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ELISA中非特异性显色原因

时间:2019-07-31 17:33    浏览:

ELISA中非特异性显色原因分析

 

【摘要】:影响ELISA中非特异性显色的原因很多,如试剂盒特异性、检验标本中含酶标记物的干扰物,操作过程中的问题。本文就这一原因作一简要分析,以便可以通过以上措施把非特异显色降至最低限度,从而提高检测的特异性,并得到更准确、可靠的实验结果。

【关键词】 ELISA 非特异性 显色

酶联免疫吸附试验(ELISA)自1971年自问世以来,以其敏感性高,特异性强,操作简便、安全,而广泛应用于临床诊断,开创了免疫学诊断的新纪元。但同其它免疫诊断方法一样酶免试剂在它的研究、生产及使用中常常会碰到非特异性问题,本文就在实验过程中产生的一些原因及如何采取一些措施,消除非特异性显色作一分析。

1、试剂盒特异性因素

1、1 固相载体的选择。ELISA中常用的固相载体有微量滴定板、小珠和小试管三种,以微量滴定板最为常见[1]。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别,各产品的质量差异很大。因此,在选择试剂盒同时要对其使用的微孔板型号进行认证,评估。

1、2包被物的纯度。在酶联免疫测定尤其是间接ELISA中,试剂的特异性取决于使用抗原的纯度。目前由于技术条件的限制,包被用抗原或抗体的纯度不可能达到100%,所以有些非特异性显色不可避免,只能尽可能提高纯度,提高特异性。目前使用的包被抗原一般为合成多肽抗原。

1、3包被抗体的效价。具有高亲和力和高特异性的包被抗体,是决定试剂特异性的重要方面。

1、4 封闭。是ELISA中重要的一步,目的是封闭固相载体表面尚未被所占据的空隙[2],减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰。

2、检验标本中含有酶标记物的干扰物

2、1内源性干扰物:类风湿因子(RF)、黄疸等,类风湿因子是可作用于多种动物以及人IgGFc段的自身抗体,多数为IgM类,能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应,从而呈现非特异性显色。

黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶,如用辣根过氧化物酶为标记物,就有可能产生非特异性显色。

2、2 外源性干扰物,常常因样品采集、贮存、处理不当造成如样品溶血,被细菌污染,标本凝集不全等。溶血标本,红细胞溶解破裂,释放出血红素形成,而血红素中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP(辣根过氧化酶)[2],有国内报道酶免HBsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性[3]。如在冰箱中保存过久,其中的IgG可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,血标本在采集处理时应小心,在冰箱中保存不易过久。

标本凝集不全时,血清中会残留部分纤维蛋白原,也易造成假阳性。

3、操作过程中的问题造成假阳性

3、1加样

对于间接ELISA标本一般都要进行稀释,如果加样不准就会造成误差,尤其当稀释倍数大时,很小的绝对误差,会导致较大的相对误差,使阴性(或弱阳性)标本呈阳性(或阴性)。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。目前,大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本,可较好地避免以上误差。

3、2洗涤

在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步,应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作,得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关,ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。

3、3 温育

每种试剂都有其最佳反应模式,其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高,反应时间长,会造成整板本底高,阳性率高。温育一般用湿盒或水浴,反应板不宜叠放,以保证各板温度都能迅速平衡,为避免蒸发,板上应加盖。

3、4酶标仪判读

作为记录测定结果的仪器,酶标仪的性能稳定与否,决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养,对滤光片要定期校正;其次酶标仪波长设置要正确,最好使用双波长,一个检测波长,一个参比波长,以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外,在用酶标仪读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同,使用中应详细阅读说明书

综上所述,由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化,尽管目前国际上以及我国有了部分标准血清或参比血清(血清盘)。但由于受方法学及技术条件的限制,在酶联吸附测定中有时不可避免的会出现一定的非特异性,但我们可以通过以上措施把非特异性显色降至最低限底,从而提高检测的特异性,并得到更准确、可靠的实验结果。

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